Th17细胞与儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症相关性研究

【摘要】支气管哮喘（哮喘）是由多种炎症细胞（嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞等）、气道结构细胞（气道上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞）以及多种细胞因子共同参与的气道慢性炎症性疾病。哮喘发病机制复杂，至今尚未完全阐明。气道慢性炎症是哮喘的本质，研究哮喘气道炎症发生、发展机制对于哮喘防治具有重要临床指导意义。随着对哮喘气道炎症的深入研究，人们对哮喘的认识已不再局限于嗜酸性粒细胞气道炎症，而更强调哮喘是多种细胞共同参与的气道慢性炎症。目前研究显示哮喘的气道炎症存在不同的亚型，可分为嗜酸细胞性哮喘（eosinophilicasthma，EA）和非嗜酸细胞性哮喘（non-eosinophilicasthma，NEA），其中半数以上的非嗜酸细胞性哮喘为中性粒细胞性哮喘（neutrophilicasthma，NA）。但哮喘气道中性粒细胞增多的机制目前尚未完全阐明。辅助性T淋巴细胞(Thelpercell，Th细胞)在哮喘气道慢性炎症中发挥着重要的免疫调节作用。Th2细胞占优势的Th1/Th2细胞失衡被认为是变应性哮喘气道嗜酸细胞性炎症形成及发展的免疫学基础。但有研究发现非变应性哮喘患者存在不依赖于Th2细胞免疫学机制介导的气道中性粒细胞炎症。近年来发现Th17细胞及其效应因子IL-17在支气管哮喘等变态反应性疾病中发挥重要作用，IL-17具有强大的募集、活化中性粒细胞的作用，可能是导致气道中性粒细胞增多的机制之一。但Th17细胞在不同气道炎症类型哮喘发病中的作用是否相同，在中性粒细胞性哮喘发病机制中是否存在Th17细胞分化优势，鲜有报道。我们前期动物实验通过建立中性粒细胞哮喘小鼠模型进行研究，结果显示中性粒细胞哮喘小鼠存在强烈的Th17细胞免疫、中度Th2细胞免疫反应，Th17细胞通过IL-17介导哮喘小鼠中性粒细胞性气道炎症的发生，并通过上调转录因子RORγt促进Th17细胞分化，中性粒细胞哮喘小鼠体内已分化的Th17细胞在机体高IL-7环境下，依赖JAK/STAT5信号途径激活维持其存活状态。但在人类中性粒细胞性哮喘发病机制中是否存在同样的Th17细胞分化优势是本课题所要研究的第一个问题。糖皮质激素作为治疗哮喘最有效的抗炎药物主要通过减少T淋巴细胞活化及抑制细胞因子的产生减轻气道炎症反应。对于多数哮喘患者以吸入糖皮质激素（ICS）为基础的规范化哮喘治疗可达到哮喘控制，但仍有部分患者并没有取得预期的效果，少数患者症状持续存在、甚至恶化，随着对哮喘气道炎症的深入研究，发现激素治疗效果欠佳的哮喘患者多为中性粒细胞哮喘。近年有研究发现，糖皮质激素不能抑制Th17细胞及其效应因子IL-17介导的气道中性粒细胞炎症，但亦有研究显示糖皮质激素治疗可下调IL-17表达，我们前期动物实验研究亦发现地塞米松可通过下调中性粒细胞哮喘小鼠Th17细胞特异性转录因子RORγt表达水平，降低Th17细胞数量及其相关细胞因子IL-17水平，部分减轻哮喘小鼠气道中性粒细胞炎症。但地塞米松对Th17细胞存活延长的状态及气道中性粒细胞凋亡率无明显影响。目前，对于糖皮质激素在Th17细胞介导的哮喘气道炎症中的作用存在不同的研究结果。我们将在探讨Th17细胞与儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症相关性的基础之上，进一步探讨糖皮质激素对Th17细胞介导的儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症的作用。本研究将初步阐明Th17细胞在儿童中性粒细胞性哮喘发病中的作用，为儿童中性粒细胞性哮喘的治疗寻求新线索及提供理论依据，有助于哮喘的个体化治疗。研究分为两部分进行：第一部分Th17细胞及相关细胞因子与儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症相关性分析目的探讨Th17细胞及相关细胞因子与儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症的相关性。方法随机选取28例未应用糖皮质激素治疗急性发作期哮喘患儿，进行肺功能测定、诱导痰细胞分类计数，并根据诱导痰液细胞学分类分成三组：嗜酸细胞性哮喘（EA组）12例；中性粒细胞哮喘（NA组）10例；非嗜酸细胞非中性粒细胞性哮喘（NEA+NNA组）共6例，并选取健康对照组(HC组)10例，采用流式细胞术检测外周血Th17、Th2细胞及Th17细胞上Ki-67、STAT5、BCL-2的表达；实时荧光定量聚合酶链反应（Real-timePCR）检测外周血单个核细胞RORγt-mRNA的表达；ELISA方法检测痰上清液、血浆、经PMA刺激的PBMC培养上清液IL-17浓度、痰上清液IL-8、IL-5浓度，并进行相关性分析。结果1、NA组外周血Th细胞中Th17细胞百分比较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组Th17细胞百分比较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间Th17细胞百分比比较差异无统计学意义(p>0.05)；EA组外周血Th细胞中Th2细胞百分比较NA组、NEA+NNA组、HC组均增高(p<0.01)，NA组、NEA+NNA组Th2细胞百分比较HC组增高(p<0.01)，NA组与NEA+NNA组间Th2细胞百分比比较差异无统计学意义(p>0.05)；2、NA组外周血Th17细胞Ki-67表达阳性率较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组Th17细胞Ki-67表达阳性率较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间Th17细胞Ki-67表达阳性率比较差异无统计学意义(p>0.05)；NA组外周血Th17细胞STAT5表达阳性率较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组Th17细胞STAT5表达阳性率较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间Th17细胞STAT5表达阳性率比较差异无统计学意义(p>0.05)；NA组外周血Th17细胞BCL-2表达阳性率较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组与HC组间Th17细胞BCL-2表达阳性率比较差异无统计学意义(p>0.05)；3、NA组外周血单个核细胞RORγt-mRNA表达较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组RORγt-mRNA表达较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间RORγt-mRNA表达比较差异无统计学意义(p>0.05)；4、NA组痰上清液IL-17浓度较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组痰上清液IL-17浓度较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间痰上清液IL-17浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)；EA组痰上清液IL-5浓度较NA组、NEA+NNA组、HC组均增高(p<0.01)，NA组、NEA+NNA组痰上清液IL-5浓度较HC组增高(p<0.01)，NA组与NEA+NNA组间痰上清液IL-5浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)；NA组痰上清液IL-8浓度较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组痰上清液IL-8浓度较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间痰上清液IL-8浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)；5、NA组、EA组、NEA+NNA组与HC组间血浆IL-17浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)，但经PMA刺激培养后，NA组PBMC培养上清液IL-17浓度较EA组、NEA+NNA组、HC组均明显增高(p<0.01)，EA组、NEA+NNA组PBMC培养上清液IL-17浓度较HC组增高(p<0.01)，EA组与NEA+NNA组间PBMC培养上清液IL-17浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)；同时，经PMA刺激培养后，NA组、EA组、NEA+NNA组PBMC培养上清液IL-17浓度较血浆IL-17浓度均明显增高(p均<0.01)，HC组PBMC培养上清液IL-17浓度与血浆IL-17浓度比较差异无统计学意义(p>0.05)。6、哮喘患儿诱导痰NEU百分比与外周血Th细胞中Th17细胞比例及痰上清IL-17、IL-8、PBMC培养上清液IL-17浓度呈明显正相关；哮喘患儿诱导痰NEU百分比与FEV1%pred、PEF%pred呈明显负相关；哮喘患儿诱导痰EOS百分比与外周血Th细胞中Th2细胞比例及痰上清IL-5浓度呈明显正相关。结论1、Th17细胞和Th2细胞均不同程度共同参与儿童哮喘的发病。儿童中性粒细胞性哮喘外周血Th17细胞、特异性转录因子RORγt表达及痰液IL-17水平均明显高于嗜酸细胞性哮喘及非嗜酸细胞非中性粒细胞性哮喘，并且与诱导痰中性粒细胞比例呈正相关。提示Th17细胞可能通过IL-17介导中性粒细胞性哮喘气道炎症的发生。2、儿童中性粒细胞性哮喘体内已分化的Th17细胞存活延长，可能与JAK/STAT5信号途径激活有关。第二部分吸入糖皮质激素对Th17细胞介导的儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症的影响目的探讨吸入糖皮质激素对Th17细胞介导的儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症的影响方法第一部分研究对象中的中性粒细胞性哮喘患儿(NA组)10例，在医师指导下规则吸入糖皮质激素治疗3个月后，进行肺功能测定、诱导痰细胞分类计数；采用流式细胞术检测外周血Th17细胞及Th17细胞上Ki-67、的表达；实时荧光定量聚合酶链反应（Real-timePCR）检测外周血单个核细胞RORγt-mRNA的表达；ELISA方法检测痰上清液、PBMC培养上清液IL-17浓度。结果1、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后FEV1%pred、PEF%pred均较治疗前明显增高(均p<0.01)，但仍低于健康对照组（P均<0.05）；2、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后诱导痰NEU百分比较治疗前明显降低(p<0.01)，但仍高于健康对照组（P<0.05）；3、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后外周血Th17细胞及Th17细胞Ki-67表达均较治疗前明显降低(均p<0.01)，但仍高于健康对照组（均P<0.01）；4、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后外周血单个核细胞RORγt-mRNA表达较治疗前明显降低(p<0.01)，与健康对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)；5、NA组规则吸入糖皮质激素治疗后痰上清液及PBMC培养上清液IL-17浓度均较治疗前降低(分别为：p<0.05，p<0.01)，但仍高于健康对照组（均P<0.01）。结论吸入糖皮质激素可通过下调特异性转录因子RORγt的表达水平，在一定程度上降低外周血Th17细胞及痰液IL-17水平，减轻Th17细胞介导的儿童中性粒细胞性哮喘气道炎症。
【作者】廖竞；
【导师】农光民；
【作者基本信息】广西医科大学，儿科学，2014，博士
【关键词】哮喘；中性粒细胞；Th17细胞；IL-17；儿童；吸入糖皮质激素；

【参考文献】
[1]丁丹.经外耳道声频共振导入利多卡因治疗感音神经性耳鸣的临床研究[D].遵义医学院,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[2]张媛.检察院对非法证据的诉讼监督以及法律适用[D].内蒙古大学,法律,2013,硕士.
[3]郭燕燕.废名的诗歌批评思想研究[D].厦门大学,文艺学,2014,硕士.
[4]张岿瀚.《庄子·内七篇》的“逍遥”思想研究[D].云南财经大学,伦理学,2014,硕士.
[5]苏莎莎.Mir-10b调节K1f4介导的巨噬细胞极化并抑制T_H1T_H17细胞反应[D].南方医科大学,内科学,2014,博士.
[6]朱玉奎.学习理论中正则化算法若干问题的研究[D].济南大学,应用数学,2012,硕士.
[7]唐彬彬.解析“前沿930”的新闻故事化[D].苏州大学,新闻与传播（专业学位）,2013,硕士.
[8].第2届未来热处理及表面工程与能源国际会议暨2014年北京香山材料热处理与表面工程国际论坛邀请函[J].金属热处理,2014,08:166-167.
[9]秦岩.褐斑鲬分类地位及其形态学、遗传学研究[D].中国海洋大学,渔业资源,2014,硕士.
[10]董耀武.关于先进Ⅰ-3型和5型编码扫描发生器的改进[J].石油地球物理勘探,1996,S2:148-150+152.
[11]韦拥军.长沙望城坡公交枢纽立体停保场工程施工风险管理研究[D].湖南大学,工商管理,2012,硕士.
[12]陈玉萍.基于内存索引和位图的多项集序列模式挖掘算法研究[D].燕山大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[13]刘俊萍.基于AHP和GIS的海塘工程安全评价研究[J].浙江工业大学学报,2014,04:383-387.
[14]梁明伟.当代中国社会必要的教育理念[D].曲阜师范大学,教育学原理,2004,硕士.
[15]陈其国,郑小虎.蒸发冷却器出口温度自动控制[J].冶金自动化,2008,01:64-65+68.
[16]吴少敏,万德钧,黄仁.基于非线性规划的指数自回归模型的辨识[J].控制与决策,1995,01:60-64.
[17]张裕明,吴林.残差初值的自适应估计[J].自动化学报,1991,04:395-403.
[18]刘圣勇,王森,刘小二,谢海江,周恒涛,高林朝.生物质成型燃料热风炉干燥玉米的试验[J].农业机械学报.2007(10)
[19]徐强强.准固态DSSC的凝胶态电解质和共轭聚合物对电极的制备、组装与性能研究[D].西安科技大学,化学工艺,2014,硕士.
[20]张彦创.风电机组状态监测与故障诊断系统的设计与实现[D].吉林大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[21]陆美娅,丁华慧,叶景甲,童星,张全.农药细胞毒性及其机理的研究现状[J].安徽农业科学,2013,12:5291-5294.
[22]佘江江.AEI新型分子筛催化剂模板剂的合成研究[D].西北大学,工业催化,2013,硕士.
[23]李世达.预制混凝土框架柱及节点抗震性能试验研究[D].哈尔滨工业大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[24]王芳.远红外对流粮食干燥机的优化设计[D].河南科技大学,食品科学,2013,硕士.
[25]张雪妮.小麦雌性育性基因初步定位[D].新疆农业大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[26]鲁选会.关于西藏自治区电信公司人力资源管理战略性思考[D].四川大学,工商管理,2003,硕士.
[27]周喆.金融文本理解的特征选择研究[D].厦门大学,控制工程,2014,硕士.
[28]罗战友,夏建中,龚晓南,刘薇.考虑孔压消散的静压单桩挤土位移场研究[J].岩石力学与工程学报,2014,S1:2765-2772.
[29]高波,洪涛.中国住宅市场羊群行为研究——基于1999～2005动态面板模型的实证分析[J].管理世界,2008,02:90-96.
[30]翁春发.原发性高血压患者血浆ALD与KCNJ5基因多态性的相关性分析[D].福建医科大学,内科学,2014,硕士.
[31]冯夫磊.汽车液压升降尾板运动仿真及结构优化[D].华东交通大学,机械电子工程,2013,硕士.
[32]李行,白丽,马成林,钟文才,杨文挺.2005～2015年吉林省农机装备水平预测分析[J].农业机械学报.2005(11)
[33]苏成元.麦氏安瘿蜂体内侵染Wolbachia的WO噬菌体的检测及其orf7基因序列分析[D].中南林业科技大学,动物学,2014,硕士.
[34]翟正.HTiNbO_5纳米片及其可见光下降解罗丹明B的催化性能研究[D].南京大学,2011.
[35]张建新.交锁髓内钉早期动力化在促进胫骨骨折愈合及控制不良情况发生中的效果研究[D].浙江大学,外科学,2013,硕士.
[36]胡煌鹤.莆田地区护工的用工需求和现状调查与对策[D].福建医科大学,社会医学与卫生事业管理,2014,硕士.
[37]许庆强,许扬,周栋骥,奚雪峰.小电阻接地配电网线路保护单相高阻接地分析[J].电力系统自动化,2010,09:91-94+115.
[38]冯香智.差异行为纳什均衡模型的股票定价驱动研究[D].复旦大学,世界经济,2012,硕士.
[39]石忠涛.Fenton氧化邻、间、对甲酚废水及其过程控制的基础研究[D].河北工程大学,环境工程,2012,硕士.
[40]王珍.从会话含义角度解读《生活大爆炸》中的言语幽默[D].山东大学,英语语言文学,2013,硕士.
[41]于潇.基于脉搏波速度的无创连续血压测量系统研究[D].吉林大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[42]刘新磊.中央企业社会责任风险应对研究[D].中共中央党校,科学社会主义与国际共产主义运动,2013,硕士.
[43]嘉红云.单纯性肥胖儿童肾素血管紧张素系统与心血管疾病易患因素的关系探讨[D].山西医科大学,小儿心血管内科,2002,硕士.
[44]王丽杰.快速检测牛奶成分的近红外光谱测量方法及系统研究[D].哈尔滨理工大学,2006.
[45]理康.加速试验温度控制系统研究[D].中北大学,机械电子工程,2013,硕士.
[46]周冲.液体直接散热型LED室内灯研究[D].重庆大学,仪器科学与技术,2014,硕士.
[47]高伏音.小学中年级班级合唱的教学模式探究[D].首都师范大学,小学教育,2014,硕士.
[48]郑东东.人乳头瘤病毒（HPV）衣壳蛋白L1五聚体形成的体外可控自组装[D].吉林大学,物理化学,2014,硕士.
[49]SAMPULIELIJAHMWALWALA.认知无线电盲感知[D].华中师范大学,电路与系统,2014,硕士.
[50]师文庆.基于振镜扫描的激光微焊接技术研究[D].华南理工大学,2010.